Thesis by SABRAOUI Abbas
Feedback loop process to control acoustic cavitation : application to cell transfection
Defended on 27 january 2012
Currently, several studies on transfection focus on the development of efficient vectors, and especially on the use of physical methods of transfection. For several years, a new approach has been explored: the sonoporation. By utilizing the ultrasound energy, this approach promotes the transfer of genes through the cytoplasmic membrane of cells. However, few works concentrate on the sonoporation mechanism. The aim of the present work, which is based on the study and the control of acoustic cavitation, is to develop an efficient sonoporation system to transfect the cells in suspension and the adherent cells. The manuscript is composed of three chapters. The first one takes a glance on the state of art of different physical techniques used in cells transfection, and more precisely on sonoporation. It has been shown that the principal mechanism of sonoporation is closely linked to acoustic cavitation. Thus, a control of this random phenomenon is important to increase the rate of transfection while keeping strong cell viability. In the second chapter, a regulated cavitation generator based on an acoustic index was studied. This index is based on the measure of broad band noise emitted during the implosion of the cavitation bubbles. The validity of this system was tested in continuous regime, notably using a chemical dosage of the hydroxyl radicals formed by inertial cavitation. The advantage of such a system is: a control in real time of the level cavitation during sonication, leading to a better reproducibility and stability of the cavitation level, especially for the moderate intensities which are required to insure a good compromise between transfection rate and cell viability. In the third chapter, in order further study the sonoporation mechanisms, a second regulated cavitation generator was studied its aim is to be able to visualize the medium during sonication. This new device is adapted to the performance under a fluorescencemicroscope with fluorescence transmission. In order to obtain information about the spatial character of the generated ultrasound cavitation, and before considering the transfection of adherent cells, we characterized the acoustic field and the streaming in the culture well near the membrane, by acoustic measurement and by fluorescent particles flow measurements. SiRNAs transfection, was validated in vitro by attending a rate of 40 % of transfection for the two types of cells, with a very low rate of mortality (< 10%), for both suspended cells (RL of follicular lymphoma) and adherent cells (Cancer of breast MDA-MB 231).
Régulation de la cavitation acoustique appliquée à la transfection cellulaire
Soutenue le 27 January 2012
Nombreux travaux de recherche sur la transfection se concentrent actuellement sur le développement de vecteurs efficaces et particulièrement sur l’utilisation de méthodes physiques de transfection. Depuis une dizaine d’années, une nouvelle approche est explorée, la sonoporation, qui consiste en l’utilisation des ultrasons pour favoriser le transfert à travers la paroi cytoplasmique. Cependant, peu d’études portent sur les mécanismes de la sonoporation, ce qui limite les avancées dans ce domaine. Le travail présenté ici porte sur l’étude et le contrôle de la cavitation acoustique dans le but de développer un système de sonoporation efficace pour les cellules en suspension et les cellules adhérentes. Le manuscrit est composé de trois chapitres. Tout d’abord, une revue de la littérature sur les différentes techniques physiques utilisées en transfection cellulaire, et plus particulièrement la sonoporation. Il a été démontré que le principal mécanisme de la sonoporation est étroitement lié au phénomène de cavitation acoustique. Un contrôle de ce phénomène aléatoire apparaît alors intéressant afin d’augmenter le taux de transfection tout en gardant une forte viabilité cellulaire. Dans le second chapitre, un système de régulation de cavitation ultrasonore basé sur un indice acoustique de cavitation a été étudié. Cet indice, est basé sur la mesure de bruit large bande émis lors de l’implosion des bulles de cavitation. La validité de ce système est tout d’abord testée en régime continu, par un dosage chimique des radicaux hydroxyles formés lors de l’implosion des bulles. Les avantages d’un tel système sont : un suivi en temps réel du niveau de cavitation durant l’irradiation, des informations quasi-instantanées sur les composantes spectrales caractéristiques de la cavitation, une meilleure reproductibilité et stabilité du niveau de cavitation surtout pour les intensités modérés qui sont requises pour assurer un bon compromis entre la transfection et la viabilité cellulaire. Dans le troisième chapitre, pour comprendre les mécanismes de la sonoporation, un deuxième système de cavitation contrôlé a été conçu dans le but de permettre une visualisation du milieu en cours d’insonification. Ce nouveau dispositif est adapté à un fonctionnement sous microscope photonique à transmission et à fluorescence. Pour obtenir une information sur le caractère spatial de la cavitation ultrasonore générée, et en vue de la transfection de cellules adhérentes dans un puits de culture biologique, on a caractérisé le champ acoustique et le streaming dans le puits de culture près de la paroi, par la mesure du champ acoustique et par l’étude des écoulements en utilisant des particules fluorescentes (3µm). Des essais de transfection de siRNAs, sur les cellules en suspension (RL du lymphome folliculaire) et sur les cellules adhérentes (cancer du sein MDA-MB 231) ont permis de valider in vitro l’efficacité de ce système en atteignant un taux de 40 % de transfection pour ces deux types de cellules, avec un très faible taux de mortalité (< 10 %).
Defended on 27 january 2012
Currently, several studies on transfection focus on the development of efficient vectors, and especially on the use of physical methods of transfection. For several years, a new approach has been explored: the sonoporation. By utilizing the ultrasound energy, this approach promotes the transfer of genes through the cytoplasmic membrane of cells. However, few works concentrate on the sonoporation mechanism. The aim of the present work, which is based on the study and the control of acoustic cavitation, is to develop an efficient sonoporation system to transfect the cells in suspension and the adherent cells. The manuscript is composed of three chapters. The first one takes a glance on the state of art of different physical techniques used in cells transfection, and more precisely on sonoporation. It has been shown that the principal mechanism of sonoporation is closely linked to acoustic cavitation. Thus, a control of this random phenomenon is important to increase the rate of transfection while keeping strong cell viability. In the second chapter, a regulated cavitation generator based on an acoustic index was studied. This index is based on the measure of broad band noise emitted during the implosion of the cavitation bubbles. The validity of this system was tested in continuous regime, notably using a chemical dosage of the hydroxyl radicals formed by inertial cavitation. The advantage of such a system is: a control in real time of the level cavitation during sonication, leading to a better reproducibility and stability of the cavitation level, especially for the moderate intensities which are required to insure a good compromise between transfection rate and cell viability. In the third chapter, in order further study the sonoporation mechanisms, a second regulated cavitation generator was studied its aim is to be able to visualize the medium during sonication. This new device is adapted to the performance under a fluorescencemicroscope with fluorescence transmission. In order to obtain information about the spatial character of the generated ultrasound cavitation, and before considering the transfection of adherent cells, we characterized the acoustic field and the streaming in the culture well near the membrane, by acoustic measurement and by fluorescent particles flow measurements. SiRNAs transfection, was validated in vitro by attending a rate of 40 % of transfection for the two types of cells, with a very low rate of mortality (< 10%), for both suspended cells (RL of follicular lymphoma) and adherent cells (Cancer of breast MDA-MB 231).
Régulation de la cavitation acoustique appliquée à la transfection cellulaire
Soutenue le 27 January 2012
Nombreux travaux de recherche sur la transfection se concentrent actuellement sur le développement de vecteurs efficaces et particulièrement sur l’utilisation de méthodes physiques de transfection. Depuis une dizaine d’années, une nouvelle approche est explorée, la sonoporation, qui consiste en l’utilisation des ultrasons pour favoriser le transfert à travers la paroi cytoplasmique. Cependant, peu d’études portent sur les mécanismes de la sonoporation, ce qui limite les avancées dans ce domaine. Le travail présenté ici porte sur l’étude et le contrôle de la cavitation acoustique dans le but de développer un système de sonoporation efficace pour les cellules en suspension et les cellules adhérentes. Le manuscrit est composé de trois chapitres. Tout d’abord, une revue de la littérature sur les différentes techniques physiques utilisées en transfection cellulaire, et plus particulièrement la sonoporation. Il a été démontré que le principal mécanisme de la sonoporation est étroitement lié au phénomène de cavitation acoustique. Un contrôle de ce phénomène aléatoire apparaît alors intéressant afin d’augmenter le taux de transfection tout en gardant une forte viabilité cellulaire. Dans le second chapitre, un système de régulation de cavitation ultrasonore basé sur un indice acoustique de cavitation a été étudié. Cet indice, est basé sur la mesure de bruit large bande émis lors de l’implosion des bulles de cavitation. La validité de ce système est tout d’abord testée en régime continu, par un dosage chimique des radicaux hydroxyles formés lors de l’implosion des bulles. Les avantages d’un tel système sont : un suivi en temps réel du niveau de cavitation durant l’irradiation, des informations quasi-instantanées sur les composantes spectrales caractéristiques de la cavitation, une meilleure reproductibilité et stabilité du niveau de cavitation surtout pour les intensités modérés qui sont requises pour assurer un bon compromis entre la transfection et la viabilité cellulaire. Dans le troisième chapitre, pour comprendre les mécanismes de la sonoporation, un deuxième système de cavitation contrôlé a été conçu dans le but de permettre une visualisation du milieu en cours d’insonification. Ce nouveau dispositif est adapté à un fonctionnement sous microscope photonique à transmission et à fluorescence. Pour obtenir une information sur le caractère spatial de la cavitation ultrasonore générée, et en vue de la transfection de cellules adhérentes dans un puits de culture biologique, on a caractérisé le champ acoustique et le streaming dans le puits de culture près de la paroi, par la mesure du champ acoustique et par l’étude des écoulements en utilisant des particules fluorescentes (3µm). Des essais de transfection de siRNAs, sur les cellules en suspension (RL du lymphome folliculaire) et sur les cellules adhérentes (cancer du sein MDA-MB 231) ont permis de valider in vitro l’efficacité de ce système en atteignant un taux de 40 % de transfection pour ces deux types de cellules, avec un très faible taux de mortalité (< 10 %).
